Reverse Transcriptase Pcr Là Gì

     

PCR (hay là phản ứng tổng phù hợp chuỗi polymerase)là một kĩ thuật hiện nay đại, được ứng dụng rộng thoải mái trong Y khoa, nhưtrong chuẩn đoán căn bệnh di truyền, căn bệnh do vi khuẩn, virus, ADN “dấu vân tay”, khẳng định huyết thống...

Bạn đang xem: Reverse transcriptase pcr là gì

Nguyên lý hoạt động của PCR làtạo ra một lượng khủng các bạn dạng sao ADN từ 1 đoạn ADN lựa chọn lọc, ở môi trường in vitro giống như như trong quá trình phân bào,trong một thời gian ngắn.Lượng to ADN chế tác thành đượcso sánh, đối chiếu với những mẫu chuẩn chỉnh tại các ngân hàng dữ liệu ADN,các thông số, những đặc điểm chuẩn đã có sẵn để mang ra kết quả.

Vậy, vào trường hợpvật chất di truyền chưa hẳn là ADN thì sao?Với hầu như virus cóvật chất di truyền là ARN, liệu có áp dụng được PRC không?

Để hiểu rõ vấn đề này chúng ta cần biệt lập được 2 kiểu dáng phản ứng PCR:

Phản ứng tổng đúng theo chuỗi polymerase thời gian thực (Real-time PCR), còn gọilà qPCR.Phản ứng tổng vừa lòng chuỗi polymerase sao chép ngược(Reverse transcription PCR), hotline tắt là RT-PCR1. Bội nghịch ứng tổng hòa hợp chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR)

qPCR là quy trình khuếch đại (sao chép) một đoạn ADN khẳng định lên hàng trăm nghìn lần, đủ nhằm phân tích. Trước đó, các mẫu xét nghiệm được xử lý bằng hóa chất đểtách chiết ADN từ chủng loại đó.

qPCR, ngoàilà "PCR định lượng", còn có nhiều các ứng dụng khác, vượt trội như:

Phát hiện tại gene kim chỉ nam (Định tính). Kết quả có thể là Âm/DươngXác định phong cách gene (genotype, týp) của gene mục tiêu. Kết quả trả ra là genotype A, B, C, v.v…,

Một số phản bội ứng khuếch đại ADN có bản chất là PCR, chúng đẳng nhiệt, nghĩa là chúng chạy ở một nhiệt độ ko đổi. Và tiêu biểu vượt trội nhất là khuếch đại phụ thuộc vào enzyme Helicase – một một số loại enzyme tháo xoắn - giống như như PCR truyền thống, tuy vậy sử dụng ánh nắng mặt trời không đổi thay vì qua những bước bóc chuỗi song ADN và phối hợp/mở rộng lớn chuỗi bởi thay đổi nhiệt.

Hai cách thức phổ trở thành để phát hiện nay các sản phẩm trong qPCR là sử dụng:

Thuốc nhuộm huỳnh quang đãng không sệt hiệu đan xen với bất kỳ ADN tua kép.2. Bội nghịch ứng tổng đúng theo chuỗi polymerase coppy ngược (RT-PCR)

RT-PCR hiểu dễ dàng và đơn giản là: đầu tiên cần sử dụng quá trình phiên mã ngược (tức gửi ARN thành ADN lấy từ mẫu virus hay vi khuẩn có vật chất di truyền là ARN) để thu được ADN, tiếp nối dùng qPCR nhằm khuếch đại ADN đó, đủ để phân tích. Tiến trình RT-PCR hay cần khoảng chừng 3h hoặc hơn.

*

Hình 1. RT-PCR cùng qPCR

RT-PCR rất có thể được triển khai theo cách thức một bước và nhì bước.

* RT-qPCR một bước, quy trình tiến độ tổng phù hợp ADN (phiên mã ngược)và qPCR được triển khai trong và một ống bội phản ứng bởi cùng một enzym. Cách tiến hành này chỉ có thể sử dụng mồi đặc hiệu.

* RT-qPCR nhì bước, giai đoạn tổng đúng theo ADNvà qPCR được thực hiện trong nhị ống bội phản ứng đơn lẻ với enzym, đệm, yếu tắc và điều kiện phản ứng được buổi tối ưu cho từng giai đoạn.

*

Hình 2. Sao chép ngược (RT-PCR) và tổng hợp ADN (qPCR)

Khuôn của RT-PCR là ARN, ARNnày có thể nằm trong các thành phần hỗn hợp ARNtổng số hoặc chỉ riêng biệt mARN. Tách chiết ARNtổng số yêu cầu ít bước thực hiện hơn, hỗ trợ cho hiệu suất bóc tách chiết cao hơn đồng thời dễ dàng hơn khi định nấc lượng tế bào đầu vào. Bên cạnh ra, do không có bước có tác dụng giàu riêng rẽ mARN, thực hiện ARNtổng số không gây khác hoàn toàn trong hiệu suất bóc tách chiết những loại mARNkhác nhau. đầy đủ ưu nạm trên đã giúp cho ARN toàn bô được ưu tiên chọn làm đồ dùng liệu bắt đầu phù hợp cho RT-PCR rộng là mARN tinh không bẩn chỉ góp phản ứng gồm độ nhạy cao hơn nữa một chút.

*

Hình 3. Một số các loại mồi dùng trong RT-PCR.

Mồi (Primer) phổ biến hay sử dụng trong RT-PCR là oligo dT cùng mồi ngẫu nhiên, nó vẫn liên kết bổ sung với khuôn ARNvà có tác dụng điểm ban đầu cho phản ứng tổng hòa hợp ADN.

Xem thêm: Cái Chiếu Tiếng Anh Là Gì - Chiếc Chiếu Trong Tiếng Anh Là Gì

Enzym phiên mã ngược thực hiện phản ứng tổng phù hợp ADNctừ khuôn ARN. Một số trong những enzym tất cả hoạt tính RNAsecho phép phân bỏ khuôn ARNsau khi vẫn tổng phù hợp ADN. Ví như enzym không có hoạt tính này, có thể cần bổ sung RNAse nhằm tăng hiệu quả của qPCR.Loại enzym phiên mã ngược thường dùng là enzym phiên mã ngược của virut ung thư bạch cầu chuột moloney (M-MLV) với virus ốm gia nạm (AMV). Tiêu chuẩn của một enzym phiên mã ngược lý tưởng mang lại phản ứng RT-PCR là bao gồm độ bền nhiệt tốt, có thể chấp nhận được tổng hợp công dụng ADNở ánh nắng mặt trời cao trên phần đa khuôn ARNcó nhiều vùng cấu trúc bậc hai.

Cặp mồi lý tưởng đến phản ứng qPCR trong RT-PCR thường được thiết kế theo phong cách nằm quấn qua địa điểm nối giữa hai exon. 1 trong những hai mồi sẽ nằm cố gắng ngang địa điểm nối thân 2 exon này, để cho mồi chỉ bắt cặp sệt hiệu với ADNmà không thể link với ADNtổng số vì ở ADNtổng số chứa intron ở xen giữa những exon. Xây đắp này giúp thải trừ nguy cơ khuếch đại nhầm ADNtổng số.

Nếu ko thể xây cất mồi chùm qua địa chỉ nối giữa exon hoặc nằm tại 2 exon được phân làn bới intron dài, cần phải xử lý mẫu ARNvới enzyme RNAse-free ADNase I hoặc ds-ADNase để đào thải ADNtổng số.

*

Hình 4. Kiến tạo đoạn mồi vào RT-PCR

Khác cùng với các phương pháp PCR thường thì hay qPCR chỉ khuếch tán được ADN thì RT-PCR đến phép họ xác định được cả những nhiều loại virus, vi trùng mang vật hóa học di truyền là ARN cũng tương tự xác định được trình từ bỏ của một quãng ARN bất kì nào đó một cách dễ dàng hơn.

Đây cũng là một trong trong những phương thức được vận dụng nhiều nhất tuy nhiên song với thử nghiệm kháng thể (antibodies) để ship hàng cho truy vết cùng xét nghiệm một sô nhiều loại virus như Zika, HIV, sởi,... Nói chung tương tự như SARS-CoV-2 đang hoành hành cách đây không lâu nói riêng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. ThS. BS. Vũ Thị Thúy Chi, Xét nghiệm PCR có những ưu – nhược điểm gì? Trung vai trung phong Xét nghiệm, cơ sở y tế Đa khoa MEDLATEC, 2019

3. RT-qPCR – Các nguyên lý cơ bản, Sinh học tập phân tử, công nghệ sinh học, Dịch cùng tổng hợp từ Thermo Scientific BioMedia VN.

4. Nguyễn Thành Khôi, 4 sự thật gây mếch lòng về real-time PCR! Sinh học phân tử.

5. Xét Nghiệm SARS-CoV-2 / COVID-19, khám đa khoa Nguyễn Tri Phương.

Xem thêm: Ds Các Trường Đào Tạo Sư Phạm Khắp Cả Nước Ta, Ds Các Trường Đh, Cđ Đào Tạo Ngành Sư Phạm

6. Chuyên môn Realtime PCR – đếm download lượng virus, vi khuẩn, BioMedia, 2015.

7. TS.BS trằn Bá Thoại, Uỷ viên BCH Hội Nội máu Việt Nam, Xét nghiệm PCR vào chẩn đoán Y khoa, Đại học tập Phan Châu Trinh

Người viết bài: SV. Vũ Hoài hương GiangSV. Hoàng Quốc Cường

Hiệu đính: TS.DS. Ngô Thiện